Amniotic cell culture during different ages of gestation for karyotype analysis in bovine

Bovine karyotyping has become an important diagnostic tool in animal breeding. In the prenatal period it can diagnose several chromosomal abnormalities such as Robertsonian translocations, testicle feminization syndrome, gonadal dysgenesis and Klinefelter's syndrome. An important cell source for karyotype analysis is the amniotic fluid. It has been extensively used in humans but in bovine, however, this is not the case despite its diagnostic value. Since a small percentage of cells is viable, cells and their growth conditions as well as the handling of the material should be optimal to insure a successful analysis. For this, we have compared the growth efficiency for bovine amniocytes in two media, employing cells from 10 to 14 weeks of gestation. Amniocytes were cultured in the Amniomax (Gibco-BRL/ Life Technologies, Rockville, MD USA) medium during eleven days and in the RPMI 1640 (Gibco-BRL) medium during sixteen days at 37§C and 5 por cento CO2, then fixed and GTG banded. All the cultures with RPMI showed a poor cell growth, regardless the gestational age. Out of the samples cultured in Amniomax one presented 100 por cento of cellular confluence at day 11 (10 weeks of gestation) and the others resulted in an increased proliferation compared with those that were cultured in RPMI. To ensure a successful karyotyping, amniotic fluid from cows with gestational ages of 10-12 weeks should be used and care should be taken for critical steps in preparation of spread metaphases - hypotonic and trypsin treatments

Induçäo de interferon humano de membrana aminiótica: papel de particulas defectivas interferentes / induction of human amniotic interferon by strains of paramyxovirus: Role of defective interfering particles

Resumo: A amostra Cantell de vírus parainfluenza 1 necessita de partículas defectivas interferentes (DI) para a produçäo de interferon (IFN) humano. A amostra Mill Hill do vírus da doença de Newcastle aparentemente näo as requer, embopra seja um indutor de IFN ainda mais potente. Para examinar este comportamento diverso, foram feitas passagens seriadas em ovos embrionados em baixa e alta multiciplidade de infecçäo com estes vírus, sendo que esta última propicia a formaçäo de particulas DI. Após cada passagem, o interferon humano de membrana aminiótica (IFN-MA) foi induzido e foram determinados os títulos hemaglutinante e infeccioso dos vírus e o do IFN-MA. A amostra Cantell mostrou uma reduçäo de 10.000 vezes em seu titulo infeccioso com as passagens em alta multiciplidade. Os títulos de IFN-MA produzidos foram cerca de 300 unidades por ml nas passagens em baixa multiciplidade. Contudo, a capacidade indutora desta amostra subiu de 1.200 para 4.200 unidades por ml nas passagens com alta multiplicidade. Coma amostra Mill Hill, as passagens seriadas em baixa ou alta multiplicidade de infecçäo näo modificaram os títulos infectantes ou as quantidades geradas de IFN-MA pela amostrra Cantell. Com a amostra Mill Hill, todavia, näo pode ser demonstrada a formaçäo de partículas DI, nem modificaçöes dos títulos de IFN-MA foram observados com a adiçäo de partículas DI da amostra Cantell (au)

Preservaçäo de interferon de membrana amniótica humana / Preservation of the human amniotic membrane interferon

Foram realizadas investigaçöessobre a presença do interferon de membrana amniótica humana (IFN-AM) a fim de permitir pesquisas posteriores a respeito de sua purificaçäo, propriedades químicas e biológicas e ensaios clínicos.Testes de inativaçäo rápida foram realizados para ensejar resultados imediatos.IFN-AM foi preparado pela infecçäo de âmnios pelo vírus da doença de Newcastle.A atividade anti-vírica do IFN-AM foi determinada em um sistema de células Vero-vírus da encefalomiocardite de camundongo ou vírus Sindbis.Para os testes de inativaçäo, preparaçöes de IFN-AM contendo 0;1 e 2 por cento de soro de carneiro foram aquecidas em temperaturas de 35ºC a 100ºC em tempos variáveis e foi medida a atividade antivírica residual.Destes dados, foi calculada a constante de Arrhenius de queda de atividade pelo calor, que foi representada graficamente contra a temperatura absoluta.Os dados de temperaturas altas(45ºC e acima) foram extrapolados para temperaturas baixas(37ºC e abaixo).Os resultados mostraram que o IFN-AM preservou-se melhor em pH 2 em presença de soro.Os dados obtidos nas temperaturas de 45º, 55º e 65ºC permitiram o cálculo de constante de Arrhenius de queda para baixas temperaturas por extrapolaçäo.A -4, 2ºC näo deverá ocorrer perda de ativadade do IFN-AM.

A concentraçäo de interferon humano de membranas amnióticas: I- métodos fácicos / The concentration of human amniotic membrane interferon: I physical methods

A concentraçäo de preparaçöes de interferon humano de membranas amnióticas (IFN-MA) por métodos fásicos foi investigada. As preparaçöes foram obtidas a partir de âmnios infectados com o vírus da doença de Newcastle e o seu título de atividade anti-vírica foi determinado em células Vero, tendo como desafio o vírus da encefalomiocardite de camundongo ou o vírus Sindbis. A concentraçäo por diálise contra pressäo negativa, com as preparaçöes em pH2, mostrou recuperaçöes de IFN acima de 50//. O método, apesar de bastante lento, foi considerado conveniente para pequenos volumes (até 100ml). A diálise contra substância higroscápica (aquacide) na qual a água das preparaçöes retiradas por substância colocada externamente à membrana de diálise foi satisfatório, permitindo concentraçöes rápidas, de 6 a 10 vezes, com recuperaçöes acima de 50//, sobretudo se o material fosse dialisado posteriormente em água acidulada. A filtraçäo molecular utilizando membranas Millipore PSAC ou PTGC e Amicon näo concentradas previamente pela precipitaçäo com ácido tricloroáctico permitiu a concentraçäo sem perdas do IFN-MA

A concentraçäo de interferon humano de membranas amnióticas: II - métodos químicos / Concentrations of the human amniotic membrane interferon: II - Chemical methods

Foi investigada a concentraçäo do interferon humano de membranas amnióticas (IFN-MA) por precipitaçäo através de métodos químicos. O IFN-MA foi produzido em âmnios infectados com o vírus da doença de Newcastle em meio contendo diferentes concentraçöes de soro. A atividade anti-vírica das preparaçöes foi titulada em células Vero infectadas com o vírus da encefalomiocardite de camundongo ou o vírus Sindbis. A precipitaçäo de IFN-MA, consideradas baixas. Empregando-se sulfato de âmnio em preparaçöes com 1//de soro, pode-se recuperar quantidades acima de 60//. O método mais adequado de concentraçäo de IFN-MA contendo 1//de soro foi a precipitaçäo com ácido tricloroactico e ressuspenso do matrial com tampäo clorto pH2, com recuperaçöes em torno de 100//da atividade. As tentativas de concentrar IFN-MA preparado sem soro por estes métodos näo permitiu uma precipitaçäo adequada

Purification of human anmiotic membrane interferon by affinity chromatography

A purificaçäo do interferon humano de membranas amnióticas foi realizada para se obter preparaçöes purificadas para sua caracterizaçäo físico-química, estudo de suas atividades biológicas e ensaios terapêuticos. O interferon foi produzido em doença de Newcastle ou o vírus Sendai. A determinaçäo da atividade anti-vírica foi feita em células Vero infectadas com o vírus da encefalomiocardite de camundongo. As preparaçöes de interferon foram concentradas por precipitaçäo por ácido tricloroactivo e cromatografadas em "Blue-Sepharose- concanavalina A, Sepharose ligada ao dipeptídeo triptofnio (trf) - triptofânio ao dipeptídeo triptofânio-tirosina (tyr). Com a "Blue-Sepharose", o pH ótimo de ligaçäo do interferon foi 5,4. A aplicaçäo em batelada mostrou que foram ligadas 37.000 unidades de interferon por ml de gel, sendo portanto, mais eficiente que a aplicaçäo em coluna, na qual somente foram ligadas 17.750 unidades por ml de gel. As fraçöes do pico de atividade foram purificadas 274 vezes, com 12//de recuperaçäo do interferon em um experimento, com um total de 78//de recuperaçäo e um fator de purificaçäo atingido foi de apenas 6,7; os ligantes Sepharose trp-trp e trp-tyr mostraram uma ligaçäo baixa do interferon, menor que 10.000 unidades por ml de gel

Produçäo de interferon humano de membranas amnióticas em microtécnica / Production of human amniotic interferon by microtechnique

Foi desenvolvido um sistema de produçäo de interferon humano de membranas amnióticas (IFN-MA) em microtécnica. Fragmentos de âmnio de 1,4 ou 2,2cm de diâmetro, em placas de microtécnica (24 câmaras), foram infectados por vírus Sendai e o IFN-MA resultante foi titulado. Maiores títulos (12.800 e 13.000 unidades por ml) foram obtidos quando utilizadas quantidades de meio de 0,5ml e 1,0ml); 6,4 unidades hemaglutinantes do vírus Sendai e um fragmento por câmara. Níveis de IFN-MA mais consistentes e altos foram alcançados na regiäo coriônica do âmnio (6.000 a 9.600 unidades/ml) quando comparados com aqueles da regiäo umbilical (860 a 2.500 unidades/ml) e reflexa (200 a 6.500 unidades/ml). O sistema com fragmentos de 2,2cm de diâmetro produziu, em média, quantidades de interferon/ml superiores (9.300 unidades/ml) quando comparado ao da produçäo do âmnio total (2.200 unidades/ml). Apesar da variabilidade nos títulos produzidos individualmente pelos fragmentos de 2,2cm de diâmetro, devido a econômia de tempo e de materiais e aos altos níveis de IFN resultantes, a microtécnica poderá se empregada quando um grande número de variáveis for investigada

Produçäo de interferon por placenta humana / Production of interferon by human placenta

No presente trabalho, foi investigada a produçäo de interferon nos tecidos da placenta humana induzidos por diferentes vírus. A membrana amniótica mostrou ser mais eficiente produtora de interferon quando infectada pelo vírus da doença de Newcastle (NDV) que a membrana ou as vilosidades coriônicas. A irradiaçäo do NDV com a luz ultravioleta (UV) diminuiu sua capacidade indutora nos três tecidos placentários. Os níveis de interferon encontrados em culturas da membrana amniótica ou coriônica, induzidos por vírus para-influenza I (Sendai), foram muito diferentes, dependendo da placenta utilizada, tanto com o vírus vivo como o tratado com a UV. Quando vilosidades coriônicas foram infectadas com este vírus, näo foi encontrada atividade de IFN. Testes comparativos mostraram que o NDV é melhor indutor de interferon do que o vírus Sendai em membrana amniótica. Os vírus Sindbis e Oriboca (vivos ou inativados pela UV) näo induziram títulos mensuráveis de interferon em qualquer dos tecidos mencionados. Concluiu-se que o sistema NDV - membrana amniótica é o mais eficiente na induçäo de IFN e merece investigaçöes mais abrangentes